Идентификация отдельных белков с помощью нанопор

Количество и типы белков, которые производят наши клетки, открывают нам важную информацию о нашем здоровье и о том, как работает организм. Однако имеющиеся у человечества методы идентификации и количественного определения отдельных белков не соответствуют поставленной задаче. Мало того, что разнообразие белков неисчислимо, часто аминокислоты изменяются после синтеза посредством посттрансляционных модификаций.

В последние годы был достигнут значительный прогресс в считывании ДНК с помощью нанопор — мембран, достаточно больших, чтобы пропустить через себя нить ДНК, но впритык. Тщательно измеряя ионное напряжение в нанопоре, когда ДНК пересекает ее, биологи смогли быстро определить порядок пар оснований в последовательности. Фактически, в этом году нанопоры были использованы для окончательного определения последовательности всего генома человека, что ранее было невозможно с помощью других технологий.

В новом исследовании, опубликованном в журнале Science, ученые из Делфтского технологического университета в Нидерландах и Иллинойского университета в Урбана-Шампейн (UIUC) в США расширили эти успехи ДНК-нанопор и представили доказательство того, что тот же метод возможен для идентификации одиночных белков, характеризуя белки с разрешением в одну аминокислоту с исчезающе малой (10-6 или 1 на миллион) погрешностью.

«Этот нанопоровый считыватель пептидов обеспечивает сайт-специфическую информацию о первичной последовательности пептида, что может найти применение в одномолекулярной дактилоскопии белков и идентификации вариантов», — пишут авторы.

Рабочие лошадки наших клеток, белки представляют собой длинные пептидные нити, состоящие из 20 различных типов аминокислот. Исследователи использовали фермент Hel308, который может присоединяться к ДНК-пептидным гибридам и контролируемо протягивать их через биологическую нанопору, известную как MspA (порин А микобактерии смегматис). Они выбрали ДНК-геликаз Hel308, потому что он может протягивать пептиды через пору с шагом в полнуклеотида, который соответствует одной аминокислоте.

Каждый шаг через узкие ворота теоретически создает уникальный сигнал тока, поскольку аминокислота частично блокирует электрический ток, переносимый ионами через нанопору.

Ведущий автор Генри Бринкерхофф, который был пионером этой работы в качестве постдока в лаборатории физика Сеса Деккера, сравнивает белок с ниткой бус разного размера. «Представьте, что вы включаете кран, медленно спуская ожерелье в слив канализации, которая в данном случае является нанопорой», — сказал он. «Если большая бусина перекрывает слив, то вода будет течь лишь струйкой; если в ожерелье прямо в отверстии слива находятся бусины меньшего размера, то через сможет пройти больше воды».

С помощью вышеуказанного метода исследователи могут очень точно измерить количество ионного тока — но не идеально, потому что ступенчатый проход через поры неравномерен. Однако, заполнив жидкую среду геликазами, исследователи могут получить множество отдельных, перекрывающихся чтений одной и той же молекулы, или, по их словам, они могут «перемотать» белок и снова прочитать его аминокислотную последовательность. Это позволило снизить погрешность с 13% практически до нуля.

Их подход позволил исследователям различать варианты пептидов, отличающиеся только одной аминокислотой, что они доказали, создав синтетические пептиды с изменением только одной аминокислоты и продемонстрировав, что система может их различать.

Но чтобы считать отдельные аминокислоты, сначала нужно было узнать, какой сигнал соответствует каждой из них при прохождении через поры. Некоторые из этих сигналов могут быть контринтуитивными, обнаружили исследователи.

Например, когда громоздкая аминокислота триптофан проходила через сужение, ионный ток сначала уменьшался, а затем, как ни странно, увеличивался по сравнению с представителями аминокислот малого и среднего размера.

Чтобы понять происхождение этих закономерностей, команда опиралась на суперкомпьютерное моделирование, проведенное биологом Алексеем Аксиментьевым (UIUC) на нескольких самых быстрых суперкомпьютерах, доступных для исследователей в мире: Frontera в Техасском центре перспективных вычислений, Blue Waters в Национальном центре суперкомпьютерных приложений и Expanse в Суперкомпьютерном центре Сан-Диего.

Команда Аксиментьева использовала метод, называемый моделированием молекулярной динамики, чтобы воссоздать поведение нанопоры, белков и окружающей среды с атомным разрешением. Такое моделирование не может полностью отразить истинную временную шкалу активности нанопоры, которая исчисляется секундами. Но, создав от 40 до 50 начальных состояний в различных позициях, а затем запустив 70 симуляций параллельно, команда смогла получить статистику для различных подтверждений пептидов. На их основе они вычислили ток и сравнили его с экспериментами. Вычислительной работой руководил Цзинцян Лю, аспирант по биофизике в лаборатории Аксиментьева.

Моделирование включало 30 000 атомов, взаимодействующих в течение 200-500 наносекунд, и совпало с экспериментальными результатами. Что еще более важно, они показали, почему некоторые аминокислоты дают контринтуитивные сигналы при прохождении через нанопору. В случае с вариантом триптофана сигнал можно проследить до связывания боковой цепи пептида с поверхностью нанопоры над сужением.

«Для каждой конкретной конформации мы могли видеть, что происходит с боковой цепью, взаимодействует ли она с поверхностью или остается внутри поры», — сказал Аксиментьев, профессор физики UIUC. «Тогда мы могли бы непосредственно установить, что связывание боковой цепи усиливает ток».

Моделирование заняло несколько недель на Frontera, 10-м по скорости суперкомпьютере в мире и самом мощном в университете. Но они заняли бы годы при использовании вычислительных кластеров, доступных в большинстве университетских городков. Исследование по идентификации одного белка, за успех которого идет глобальная гонка, было опубликовано в журнале Science в качестве заглавной статьи 4 ноября 2021 года. Исследование было поддержано Голландским исследовательским советом, Национальными институтами здравоохранения США, Национальным научным фондом США и др.

«Существуют огромные возможности для разработки диагностики путем считывания отдельных белков с помощью этого нанопорного подхода», — сказал Аксиментьев. «Вычисления будут играть большую роль в развитии этих технологий. Удивительно, что с помощью компьютерных моделей мы можем воспроизвести эксперименты и сказать, какие взаимодействия происходят на наноуровне».

Требуется дополнительная работа по считыванию длиннее 20 аминокислот и определению неоднородно заряженных аминокислот, но Аксиментьев считает, что через три-пять лет станет возможно разработать рабочую модель.

«Мы думаем, что наш новый подход позволит нам обнаруживать посттрансляционные изменения, — говорит Деккер, — и таким образом пролить свет на белки, которые мы носим в себе».

В биологии происходят прорывы, а тем временем в доменной зоне .bio скидки на регистрацию доменов. Это ли не чудо?