Новый метод обнаружения побочных эффектов CRISPR

Технология редактирования генома CRISPR, изобретенная в 2012 году, открыла широкие возможности для лечения ряда трудноизлечимых заболеваний. Тем не менее, ученые изо всех сил пытались выявить потенциальные побочные эффекты в терапевтически важных типах клеток, и это оставалось основным препятствием на пути в клиническую практику. Группа ученых из Институтов Гладстона и Института инновационной геномики (IGI) совместно с сотрудниками AstraZeneca разработали надежный метод, решающий эту проблему.

CRISPR редактирует геном человека, разрезая ДНК в определенном месте. Задача состоит в том, чтобы инструмент не делал надрезов на других участках ДНК — повреждения, которые могут привести к непредвиденным последствиям.

Бик Винерт и Стейсия Уайман нашли новый способ решения этой проблемы.

«Когда CRISPR делает разрез, ДНК разрушается», — говорит Винерт, кандидат наук, который начал работу в лаборатории IGI Джейкоба Корна и сейчас проходит докторантуру в лаборатории Брюса Р. Конклина в Гладстоне. «Итак, чтобы выжить, клетка привлекает к работе множество различных факторов восстановления ДНК в этом конкретном участке генома, дабы зафиксировать разрыв и соединить обрезанные концы вместе. Мы подумали, что, если бы мы смогли найти расположение этих факторов восстановления ДНК, то удалось бы определить участки, которые были вырезаны CRISPR. «

Чтобы проверить свою идею, исследователи изучили группу различных факторов восстановления ДНК. Они обнаружили, что фактор MRE11 появляется одним из первых на месте разреза. Используя MRE11, ученые разработали новую технику, названную DISCOVER-Seq, которая может идентифицировать точно участки в геноме, где CRISPR сделал разрез.

«Геном человека чрезвычайно велик — если вы напечатаете всю последовательность ДНК, у вас получится роман высотой с 16-этажное здание», — объясняет Конклин, доктор медицинских наук, заместитель директора IGI. «Когда мы хотим вырезать кусочек ДНК с помощью CRISPR, мы как будто пытаемся удалить одно конкретное слово на определенной странице этого романа».

«Вы можете представить факторы восстановления ДНК в виде различных закладок, добавленных в книгу», — добавляет Конклин. «Некторые из них отмечают целые главы, однако MRE11 — это закладка, которая указывает на определенную букву, которая была изменена».

В настоящее время существуют различные методы для обнаружения побочных эффектов CRISPR. Однако все они имеют ограничения, варьируемые от получения ложноположительных результатов вплоть до уничтожения исследуемых клеток. Кроме того, наиболее распространенный метод, используемый на сегодняшний день, ограничивается применением на культивируемых клетках в лаборатории, и не может быть перенесен на стволовые клетки, полученных у пациентов, или их тканей животных.

«Поскольку наш метод основан на естественном процессе восстановления клеток для выявления порезов, он оказался гораздо менее инвазивным и гораздо более надежным», — утверждает доктор философии Корн, в данный момент руководящий лабораторией в ETH Zurich. «Мы смогли протестировать наш новый метод DISCOVER-Seq в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, клетках пациентов и мышей, и наши результаты показывают, что этот метод потенциально может использоваться в любых условиях, а не только в лаборатории».

Метод DISCOVER-Seq, примененный к новым типам клеток и системам, также сформировал новое понимание механизмов, используемых CRISPR для редактирования генома, что приводит к лучшему пониманию того, как работает этот инструмент.

«Новый метод значительно упрощает процесс выявления нецелевых эффектов, а также повышает точность результатов», — говорит Конклин, профессор медицинской генетики и молекулярной фармакологии в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF). «Это может позволить нам лучше предсказать, как редактирование генома будет работать в клинических условиях. Это важный шаг в улучшении доклинических исследований и приближении основанной на CRISPR терапии к пациентам».

Поделиться